Metody wykrywania molekularnego mają zdolność wytwarzania dużej ilości kwasu nukleinowego poprzez amplifikację śladowych ilości znalezionych w próbkach.Chociaż jest to korzystne dla umożliwienia czułej detekcji, wprowadza również możliwość zanieczyszczenia poprzez rozprzestrzenianie się aerozoli amplifikacyjnych w środowisku laboratoryjnym.Podczas przeprowadzania eksperymentów można podjąć środki w celu uniknięcia zanieczyszczenia odczynników, sprzętu laboratoryjnego i powierzchni stołu, ponieważ takie zanieczyszczenie może generować wyniki fałszywie dodatnie (lub fałszywie ujemne).

Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia, należy zawsze stosować zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.W szczególności należy przedsięwziąć środki ostrożności w odniesieniu do następujących punktów:

1. Postępowanie z odczynnikami
2. Organizacja miejsca pracy i wyposażenia
3. Porady dotyczące użytkowania i czyszczenia dla wyznaczonej przestrzeni molekularnej
4. Ogólne porady z zakresu biologii molekularnej
5. Kontrole wewnętrzne
6. Bibliografia

1. Postępowanie z odczynnikami

Krótko odwirować probówki z odczynnikami przed otwarciem, aby uniknąć tworzenia się aerozoli.Podziel odczynniki na porcje, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania oraz zanieczyszczenia zapasów podstawowych.Wyraźnie oznakuj i opatrz datą wszystkie probówki z odczynnikami i reakcyjnymi oraz prowadź dzienniki numerów partii odczynników i partii używanych we wszystkich eksperymentach.Odpipetować wszystkie odczynniki i próbki za pomocą końcówek z filtrem.Przed zakupem należy upewnić się u producenta, czy końcówki z filtrem pasują do marki używanej pipety.

2. Organizacja miejsca pracy i wyposażenia

Przestrzeń robocza powinna być zorganizowana w taki sposób, aby przepływ pracy odbywał się w jednym kierunku, od obszarów czystych (przed PCR) do obszarów brudnych (po PCR).Poniższe ogólne środki ostrożności pomogą zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.Posiadać oddzielne wyznaczone pomieszczenia lub co najmniej fizycznie oddzielne obszary do: przygotowania mastermixu, ekstrakcji kwasów nukleinowych i dodawania matrycy DNA, amplifikacji i postępowania ze zamplifikowanym produktem oraz analizy produktu, np. elektroforezy żelowej.

W niektórych ustawieniach posiadanie 4 oddzielnych pokoi jest trudne.Możliwą, ale mniej pożądaną opcją jest przygotowanie mieszanki głównej w pomieszczeniu zamkniętym, np. komorze z przepływem laminarnym.W przypadku amplifikacji nested PCR przygotowanie mastermiksu do drugiej rundy reakcji powinno odbywać się w „czystym” miejscu przygotowania mastermixu, natomiast inokulacja pierwotnym produktem PCR powinna być wykonana w pomieszczeniu do amplifikacji i jeśli to możliwe w wydzielonym obszarze zabezpieczającym (np. komorze z przepływem laminarnym).

Każde pomieszczenie/obszar wymaga osobnego zestawu wyraźnie oznakowanych pipet, końcówek z filtrem, stojaków na probówki, wirówek, wirówek (jeśli dotyczy), długopisów, ogólnych odczynników laboratoryjnych, fartuchów laboratoryjnych i pudełek z rękawiczkami, które pozostaną na odpowiednich stanowiskach pracy.Podczas przemieszczania się między wyznaczonymi obszarami należy myć ręce oraz zmieniać rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.Odczynników i sprzętu nie należy przenosić z obszaru brudnego do obszaru czystego.W skrajnym przypadku, gdy odczynnik lub element wyposażenia musi zostać cofnięty, należy go najpierw odkazić 10% podchlorynem sodu, a następnie przetrzeć sterylną wodą.

Notatka

10% roztwór podchlorynu sodu należy codziennie przygotowywać na świeżo.W przypadku stosowania do odkażania należy przestrzegać minimalnego czasu kontaktu wynoszącego 10 minut.
Jeśli lokalne zalecenia dotyczące bezpieczeństwa nie zezwalają na użycie podchlorynu sodu lub jeśli podchloryn sodu nie nadaje się do odkażania metalowych części sprzętu, można również użyć dostępnych na rynku produktów, które zostały zatwierdzone jako środki do odkażania powierzchni niszczące DNA.

W idealnej sytuacji personel powinien przestrzegać etosu jednokierunkowego przepływu pracy i nie przechodzić z obszarów brudnych (po PCR) z powrotem do obszarów czystych (przed PCR) tego samego dnia.Może się jednak zdarzyć, że będzie to nieuniknione.Gdy nadarzy się taka okazja, personel musi zadbać o dokładne umycie rąk, zmianę rękawiczek, użycie wyznaczonego fartucha laboratoryjnego i niewprowadzanie żadnego sprzętu, który będzie chciał ponownie zabrać z pomieszczenia, takiego jak książki laboratoryjne.Takie środki kontroli powinny być kładzione na szkoleniach personelu w zakresie metod molekularnych.

Po użyciu ławki należy wyczyścić 10% roztworem podchlorynu sodu (a następnie sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości wybielacza), 70% etanolem lub zatwierdzonym, dostępnym w handlu środkiem odkażającym niszczącym DNA.Idealnie byłoby zamontować lampy ultrafioletowe (UV), aby umożliwić odkażanie przez napromieniowanie.Stosowanie lamp UV powinno być jednak ograniczone do zamkniętych obszarów roboczych, np. szaf bezpieczeństwa, w celu ograniczenia narażenia personelu laboratorium na promieniowanie UV.Należy przestrzegać instrukcji producenta dotyczących pielęgnacji, wentylacji i czyszczenia lamp UV, aby zapewnić ich skuteczność.

W przypadku użycia 70% etanolu zamiast podchlorynu sodu, do zakończenia odkażania konieczne będzie naświetlanie światłem UV.
Nie czyścić wirówki i wirówki podchlorynem sodu;zamiast tego przetrzyj 70% etanolem i wystaw na działanie promieni UV lub użyj komercyjnego środka odkażającego niszczącego DNA.W przypadku rozlania skontaktuj się z producentem w celu uzyskania dalszych wskazówek dotyczących czyszczenia.Jeśli pozwalają na to instrukcje producenta, pipety należy rutynowo sterylizować w autoklawie.Jeśli pipet nie można sterylizować w autoklawie, wystarczy przemyć je 10% roztworem podchlorynu sodu (a następnie dokładnie przetrzeć sterylną wodą) lub komercyjnym środkiem odkażającym niszczącym DNA, a następnie naświetlić UV.

Regularne czyszczenie za pomocą wysokoprocentowego podchlorynu sodu może ostatecznie uszkodzić plastikowe i metalowe elementy pipety;najpierw sprawdź zalecenia producenta.Cały sprzęt musi być regularnie kalibrowany zgodnie z harmonogramem zalecanym przez producenta.Wyznaczona osoba powinna być odpowiedzialna za przestrzeganie harmonogramu kalibracji, prowadzenie szczegółowych dzienników oraz wyraźne umieszczanie etykiet serwisowych na sprzęcie.

3. Porady dotyczące użytkowania i czyszczenia dla wyznaczonej przestrzeni molekularnej

Pre-PCR: Podział odczynników / przygotowanie mastermixu: Powinno to być najczystsze ze wszystkich miejsc wykorzystywanych do przygotowywania eksperymentów molekularnych, a najlepiej powinna to być komora z przepływem laminarnym wyposażona w lampę UV.Próbek, wyekstrahowanych kwasów nukleinowych i zamplifikowanych produktów PCR nie wolno dotykać w tym obszarze.Odczynniki do amplifikacji należy przechowywać w zamrażarce (lub lodówce, zgodnie z zaleceniami producenta) w tym samym wyznaczonym miejscu, najlepiej obok komory z przepływem laminarnym lub obszaru przed PCR.Rękawiczki należy zmieniać każdorazowo po wejściu do strefy pre-PCR lub komory z przepływem laminarnym.

Strefę pre-PCR lub komorę z przepływem laminarnym należy czyścić przed i po użyciu w następujący sposób: Wytrzyj wszystkie elementy w komorze, np. pipety, pojemniki na końcówki, wirówki, wirówki, stojaki na probówki, pisaki itp. 70% etanolem lub komercyjnym środkiem odkażającym niszczącym DNA i pozostawić do wyschnięcia.W przypadku zamkniętego obszaru roboczego, np. komory z przepływem laminarnym, wystawić okap na działanie promieni UV przez 30 minut.

Notatka

Nie wystawiać odczynników na działanie promieni UV;przenosić je do szafki dopiero po jej wyczyszczeniu.W przypadku przeprowadzania PCR z odwrotną transkrypcją pomocne może być również przetarcie powierzchni i sprzętu roztworem rozkładającym RNazy w kontakcie.Może to pomóc w uniknięciu fałszywie ujemnych wyników enzymatycznej degradacji RNA.Po dekontaminacji i przed przygotowaniem mastermixu należy jeszcze raz zmienić rękawiczki i wtedy szafka jest gotowa do użytku.

Pre-PCR: Ekstrakcja kwasu nukleinowego/dodanie matrycy:

Kwas nukleinowy należy ekstrahować i obchodzić się z nim w drugim wyznaczonym miejscu przy użyciu oddzielnego zestawu pipet, końcówek z filtrem, stojaków na probówki, świeżych rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i innego sprzętu. W tym obszarze można również dodawać szablony, kontrole i linie trendu do probówki lub płytki mastermixu.Aby uniknąć kontaminacji wyekstrahowanych próbek kwasu nukleinowego, które są analizowane, zaleca się zmianę rękawiczek przed kontaktem z kontrolą pozytywną lub standardami oraz użycie osobnego zestawu pipet.Odczynników PCR i amplifikowanych produktów nie wolno pipetować w tym obszarze.Próbki należy przechowywać w wyznaczonych lodówkach lub zamrażarkach w tym samym obszarze.Przestrzeń robocza sampla powinna być czyszczona w taki sam sposób jak przestrzeń mastermixu.

Post-PCR: Amplifikacja i postępowanie z amplifikowanym produktem

Ta wyznaczona przestrzeń jest przeznaczona na procesy poamplifikacyjne i powinna być fizycznie oddzielona od obszarów przed PCR.Zwykle zawiera termocyklery i platformy czasu rzeczywistego, a najlepiej powinien mieć komorę z przepływem laminarnym do dodawania produktu PCR rundy 1 do reakcji rundy 2, jeśli przeprowadzany jest zagnieżdżony PCR.Odczynników PCR i wyekstrahowanego kwasu nukleinowego nie wolno dotykać w tym obszarze, ponieważ ryzyko zanieczyszczenia jest wysokie.W tym obszarze powinien znajdować się oddzielny zestaw rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych, stojaków na płytki i probówki, pipet, końcówek z filtrem, pojemników i innego wyposażenia.Przed otwarciem probówki należy odwirować.Przestrzeń robocza sampla powinna być czyszczona w taki sam sposób jak przestrzeń mastermixu.

Post-PCR: Analiza produktu

Pomieszczenie to przeznaczone jest na sprzęt do wykrywania produktów, np. zbiorniki do elektroforezy żelowej, zasilacze, transiluminator UV oraz system dokumentacji żelowej.W tym obszarze powinny znajdować się oddzielne zestawy rękawiczek, fartuchy laboratoryjne, stojaki na płytki i probówki, pipety, końcówki z filtrem, pojemniki i inny sprzęt.Do tego obszaru nie można wnosić żadnych innych odczynników, z wyjątkiem barwnika obciążającego, markera molekularnego i żelu agarozowego oraz składników buforu.Przestrzeń robocza sampla powinna być czyszczona w taki sam sposób jak przestrzeń mastermixu.

Ważna uwaga

Idealnie byłoby, gdyby do pomieszczeń pre-PCR nie wchodzić tego samego dnia, jeśli praca została już wykonana w pokojach post-PCR.Jeśli jest to całkowicie nieuniknione, należy najpierw dokładnie umyć ręce i nosić specjalne fartuchy laboratoryjne w pomieszczeniach.Książki i dokumenty laboratoryjne nie mogą być wnoszone do pomieszczeń przed PCR, jeśli były używane w pomieszczeniach po PCR;w razie potrzeby wykonać duplikaty wydruków protokołów/identyfikatorów próbek itp.

4. Ogólne porady z zakresu biologii molekularnej

Używać rękawic bezpudrowych, aby uniknąć zahamowania testu.Właściwa technika pipetowania ma zasadnicze znaczenie dla zmniejszenia zanieczyszczenia.Nieprawidłowe pipetowanie może spowodować rozpryskiwanie podczas dozowania cieczy i tworzenie aerozoli.Dobre praktyki dotyczące prawidłowego pipetowania można znaleźć pod następującymi linkami: Przewodnik Gilsona dotyczący pipetowania, Filmy wideo dotyczące techniki pipetowania Anachem, Probówki wirówkowe przed otwarciem i otwieraj je ostrożnie, aby uniknąć rozpryskiwania.Zamknąć probówki natychmiast po użyciu, aby uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń.

W przypadku przeprowadzania wielu reakcji należy przygotować jedną mieszaninę główną zawierającą typowe odczynniki (np. wodę, dNTP, bufor, startery i enzym), aby zminimalizować liczbę transferów odczynników i zmniejszyć zagrożenie zanieczyszczeniem.Zaleca się ustawienie mastermiksu na lodzie lub zimnym bloku.Zastosowanie enzymu Hot Start może pomóc w ograniczeniu produkcji niespecyficznych produktów.Odczynniki zawierające sondy fluorescencyjne należy chronić przed światłem, aby uniknąć degradacji.

5. Kontrole wewnętrzne

Uwzględnij dobrze scharakteryzowane, potwierdzone pozytywne i negatywne kontrole wraz z kontrolą bez matrycy we wszystkich reakcjach oraz wielopunktową miareczkowaną linię trendu dla reakcji ilościowych.Kontrola pozytywna nie powinna być tak silna, aby stwarzała ryzyko zanieczyszczenia.Podczas przeprowadzania ekstrakcji kwasów nukleinowych należy uwzględnić pozytywne i negatywne kontrole ekstrakcji.

Zaleca się wywieszenie jasnych instrukcji w każdym z obszarów, tak aby użytkownicy byli świadomi zasad postępowania.Laboratoria diagnostyczne wykrywające bardzo niskie poziomy DNA lub RNA w próbkach klinicznych mogą chcieć zastosować dodatkowe środki bezpieczeństwa w postaci oddzielnych systemów uzdatniania powietrza z nieznacznie dodatnim ciśnieniem powietrza w pomieszczeniach przed PCR i nieznacznie ujemnym ciśnieniem powietrza w pomieszczeniach po PCR.

Wreszcie pomocne jest opracowanie planu zapewniania jakości (QA).Taki plan powinien zawierać wykazy zapasów podstawowych odczynników i zapasów roboczych, zasady przechowywania zestawów i odczynników, raportowanie wyników kontroli, programy szkolenia personelu, algorytmy rozwiązywania problemów oraz działania zaradcze w razie potrzeby.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Rozdział 3: Zakładanie laboratorium qPCR.Wytyczne dotyczące badania wód rekreacyjnych przy użyciu metody USEPA qPCR 1611. Lansing – Michigan State University.

Public Health England, NHS.Brytyjskie standardy badań mikrobiologicznych: Dobra praktyka laboratoryjna podczas przeprowadzania testów amplifikacji molekularnej).Wytyczne dotyczące jakości.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Utworzenie laboratorium PCR.Protokół Cold Spring Harb.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutynowa konserwacja wirówek: czyszczenie, konserwacja i dezynfekcja wirówek, wirników i adapterów (biała księga nr 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) dla testów molekularnych stosowanych w laboratoriach diagnostycznych, w: Akyar I, wyd.Szerokie spektrum kontroli jakości.Rijeka, Chorwacja: Intech;2011: 29–52.